多克隆抗體的制備以及佐劑在其制備中的應(yīng)用

一、抗體

抗體是地球生命進(jìn)化史上一類不尋常的蛋白質(zhì)，是生物醫(yī)學(xué)界的 “魔力子彈”，在哺乳動(dòng)物中，抗體能對(duì)機(jī)體固有的免疫系統(tǒng)起到增強(qiáng)和補(bǔ)充作用，當(dāng)機(jī)體遭遇外界刺激(如細(xì)菌、病毒或其他病原微生物等)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生獲得性免疫反應(yīng)，合成并分泌抗體。

抗體是宿主蛋白質(zhì)，在體內(nèi)存在外來分子時(shí)產(chǎn)生，它們主要由漿細(xì)胞合成，漿細(xì)胞是B淋巴細(xì)胞譜系中終分化的細(xì)胞，并在血液和淋巴中循環(huán)，與外來抗原結(jié)合。隨后，抗體-抗原復(fù)合物主要通過巨噬細(xì)胞的吞噬作用從循環(huán)中移除?？贵w具有重要的結(jié)構(gòu)和功能特征，在功能上，能夠結(jié)合抗原和免疫系統(tǒng)的特定細(xì)胞或蛋白質(zhì)，在結(jié)構(gòu)上，抗體由一個(gè)或多個(gè)“Y”形組成，每個(gè)“Y”含有四種多肽，兩種相同的重鏈多肽和兩種相同的輕鏈多肽。根據(jù)“Y”型的數(shù)量和它們包含的重鏈多肽的類型分為五類，即IgG、IgM、IgA、IgE和IgD，其中IgG在血清中的含量豐富。

二、多克隆抗體

由于抗原分子具有多種抗原決定簇，每一種決定簇可激活具有相應(yīng)抗原受體的B細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答，因而可產(chǎn)生多種針對(duì)不同抗原決定簇的抗體，這些由不同B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的抗體稱之為多克隆抗體。

多克隆抗體作為一種重要工具被廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究和診斷中，它們能夠識(shí)別特定的抗原物質(zhì)，可以應(yīng)用于Western blot、放射性免疫測(cè)定、ELISA、直接-間接熒光抗體檢測(cè)、紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)、免疫組化（IHC）、免疫沉淀（IP）、免疫擴(kuò)散、親和層析、酶學(xué)、基因分離等眾多實(shí)驗(yàn)中。用途極其廣泛。

高親和性多克隆抗體能夠同時(shí)識(shí)別抗原上的多個(gè)表位，通過多價(jià)結(jié)合的協(xié)同效應(yīng)大幅提升抗原抗體復(fù)合物的穩(wěn)定性。這種特性在Western Blot（WB）和ELISA等實(shí)驗(yàn)中尤為關(guān)鍵，多表位結(jié)合能夠有效放大信號(hào)并減少漏檢的風(fēng)險(xiǎn)，親和性低的抗體會(huì)因結(jié)合能力弱而導(dǎo)致信號(hào)捕獲不足而出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。而且高親和性抗體對(duì)靶蛋白的微小結(jié)構(gòu)變化（如糖基化、部分變性）具有更高容忍度，在免疫組化（IHC）等實(shí)驗(yàn)中對(duì)構(gòu)象變化的抗原仍能穩(wěn)定結(jié)合，低親和性抗體對(duì)表位構(gòu)象敏感，抗原輕微改變即可導(dǎo)致結(jié)合失效。多克隆抗體的高親和性是其核心優(yōu)勢(shì)，是保障檢測(cè)靈敏度和實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性的基石，穩(wěn)固的結(jié)合能力不僅能夠提升低豐度靶標(biāo)的檢出率，還賦予了實(shí)驗(yàn)體系更強(qiáng)的抗干擾能力

多克隆抗體與多價(jià)抗原結(jié)合

 低親和力        高親和力

三、動(dòng)物選擇

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇是制備多克隆抗體制備是否能達(dá)到預(yù)期的關(guān)鍵因素之一，廣泛的脊椎動(dòng)物物種可用于生產(chǎn)抗血清，如：兔子、小鼠、羊、馬、驢、豬等。其中兔子是常規(guī)生產(chǎn)多克隆血清的一個(gè)很好的選擇。動(dòng)物的選擇主要根據(jù)抗原的生物學(xué)特性和所需獲得抗體的數(shù)量和用途，如制備抗γ-免疫球蛋白抗血清，多用兔子和山羊，因動(dòng)物反應(yīng)良好，且能夠提供足夠數(shù)量的血清。

抗原與動(dòng)物種屬之間的關(guān)系一般認(rèn)為抗原的來源與免疫動(dòng)物的親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，免疫原性越強(qiáng)，產(chǎn)生抗體的效價(jià)越高。而同種系或親緣關(guān)系較近者，產(chǎn)生抗體的效價(jià)低，甚至不產(chǎn)生抗體。比如：針對(duì)小鼠抗原的抗體反應(yīng)可能在小鼠或大鼠中不發(fā)揮作用，但是在兔中就可以。免疫親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的哺乳動(dòng)物可產(chǎn)生高達(dá)10mg/mL的抗體，但如果免疫同種異型動(dòng)物，產(chǎn)生的抗體量低于1mg/mL，雞經(jīng)常被用來制備IgY（等同于哺乳動(dòng)物的IgG）的多克隆抗體，而且IgY不會(huì)和哺乳動(dòng)物IgG發(fā)生交叉反應(yīng)。

1. 小鼠：小鼠是嚙齒目中體型較小的動(dòng)物。新生小鼠1.5g左右，21天斷乳時(shí)12～

15g，1.5至2月齡體重達(dá)20g以上，可供實(shí)驗(yàn)使用。

2. 兔：兔耳大，表面分布有清晰的血管。有特殊的血清型和唾液型，血清型分為α＇、β＇、α＇β＇和 O 型四種。由于抗原刺激機(jī)體后，體液免疫應(yīng)答反應(yīng)強(qiáng)烈，所以兔被廣泛用于制備高效價(jià)的特異性強(qiáng)的免疫血清。應(yīng)選擇年齡在6個(gè)月以上，體重以2~3kg為宜。

3. 羊：可用于生產(chǎn)多種抗血清，優(yōu)先選擇成年個(gè)體（免疫系統(tǒng)成熟），健康狀態(tài)良好的羊。

4. 豚鼠：選擇成年（3個(gè)月以上）且健康的豚鼠（體重200-250g），此時(shí)免疫系統(tǒng)成熟，免疫后產(chǎn)生的抗體效價(jià)較高。?

四、抗原選擇

能被特異性免疫應(yīng)答所識(shí)別的分子被稱為抗原。然而，不是所有的抗原都是免疫原。免疫原是指能引起體液免疫和(或)細(xì)胞免疫的分子。如大多數(shù)蛋白質(zhì)、細(xì)菌、病毒等。分子量大于5KDa的抗原更易于刺激抗體產(chǎn)生，一些小分子物質(zhì)(半抗原)如小的多肽、多糖、類脂和某些藥物等，只有在和有活性的大分子物質(zhì)(載體，如BSA、OVA)偶聯(lián)時(shí)才能引起免疫應(yīng)答。能引起抗體應(yīng)答的抗原必定是免疫原。自然界中的抗原物質(zhì)種類繁多，包括各種天然抗原、人工抗原、合成抗原、基因工程抗原等，絕大多數(shù)的天然抗原不是單一成分，在制備抗體時(shí)需要進(jìn)行純化。一般而言，大多數(shù)動(dòng)物的免疫系統(tǒng)是非常敏感的，用于免疫的抗原建議是純化品，抗原經(jīng)12.5%的PAGE電泳后，僅出現(xiàn)一條區(qū)帶，即認(rèn)為可作為免疫用抗原。

不同動(dòng)物種類對(duì)同一抗原有不同的免疫應(yīng)答表現(xiàn)，因此對(duì)不同性質(zhì)的抗原選用的動(dòng)物也不相同。蛋白質(zhì)抗原一般適用于大多數(shù)動(dòng)物，常用的有兔和羊，但在某些動(dòng)物體內(nèi)因?yàn)橛蓄愃莆镔|(zhì)或其他的原因，蛋白質(zhì)抗原對(duì)這些動(dòng)物免疫原性極差，如兔子對(duì)胰島素、綿羊?qū)?/span>IgE、山羊?qū)Χ喾N酶類均不易產(chǎn)生抗體。甾體激素多選用兔，酶多選用豚鼠。

五、佐劑應(yīng)用

免疫佐劑是指預(yù)先或與抗原同時(shí)注入體內(nèi)，可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型的非特異性免疫增強(qiáng)性物質(zhì)，其目的是為了提高抗原對(duì)機(jī)體的免疫原性，提高機(jī)體產(chǎn)生抗體的效價(jià)。與僅使用抗原相比，其抗體的產(chǎn)量會(huì)更大。油性免疫佐劑介導(dǎo)的放大效應(yīng)包括:（1）一種免疫原的倉(cāng)庫(kù)，使其能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)緩慢釋放從而向免疫系統(tǒng)提呈；（2）免疫刺激被優(yōu)化，一般免疫刺激劑和抗原集中于同一微環(huán)境中，并同時(shí)與抗原提呈細(xì)胞和淋巴細(xì)胞相互作用；（3）免疫系統(tǒng)細(xì)胞非特異性活化，而這種活化對(duì)產(chǎn)生抗體的反應(yīng)有益。

目前動(dòng)物免疫中應(yīng)用廣泛的是弗氏佐劑和其它的一些油性佐劑，如：弗氏不完全免疫佐劑(加強(qiáng)型)、弗氏完全免疫佐劑(加強(qiáng)型)、乳化型快速完全免疫佐劑和乳化型快速不完全佐劑等，完全佐劑由不完全佐劑加卡介苗組成。由于都是油劑，因此在免疫動(dòng)物時(shí)，建議先將佐劑與抗原按合適的體積比混勻，制成油包水型乳化液。初次免疫一般用完全佐劑，刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答；再次免疫時(shí)，使用不完全佐劑。弗氏不完全免疫佐劑(加強(qiáng)型)、弗氏完全免疫佐劑(加強(qiáng)型)，乳化型快速完全免疫佐劑和乳化型快速不完全佐劑，是商品化的高效的佐劑之一。特別適合單抗研發(fā)用小鼠的免疫以及兔子、山羊、豚鼠等多克隆抗血清的制備。

在免疫動(dòng)物前，應(yīng)先將弗氏不完全免疫佐劑(加強(qiáng)型)、弗氏完全免疫佐劑(加強(qiáng)型)、乳化型快速完全免疫佐劑或乳化型快速不完全佐劑等油性佐劑與抗原按一定比例混合，制備成“油包水”乳狀液。可溶性抗原和免疫佐劑在乳化過程中，含有抗原的小水滴被油所捕獲，在非常黏的乳劑中形成顆粒，傳統(tǒng)的乳化方法有研磨法、注射器混合法、超聲法。這些方法抗原損耗大、用時(shí)長(zhǎng)且不易操作?？梢杂檬殖忠埔浩魇阶魟┤榛鬟M(jìn)行乳化，乳化過程操作簡(jiǎn)單、方便快捷、安全性高、用時(shí)少，幾分鐘就可乳化完全，且抗原幾乎無損耗。乳化器如下圖：

乳化器乳化具體操作方法有2種：（1）將佐劑先加入乳化管，然后加少部分抗原攪拌乳化幾下后再加抗原繼續(xù)乳化，直到抗原加完再乳化幾分鐘即可。（2）抗原和佐劑加入乳化管，稍等抗原會(huì)沉入底部和佐劑分層，用攪拌器自上而下慢慢攪拌佐劑入抗原層，慢慢下移這時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)混合液很快乳白越來越粘，幾分鐘就可完成。乳化示意圖如下：

乳化完成后，將一滴乳劑滴入水中，若保持完整不分散，成滴狀浮于水面，則為乳化完全，為合格的油包水劑。各成分在乳化后不會(huì)分散，在運(yùn)用到宿主組織后，才能發(fā)揮抗原倉(cāng)庫(kù)的作用。如下圖：

弗氏不完全免疫佐劑(加強(qiáng)型)、弗氏完全免疫佐劑(加強(qiáng)型)、乳化型快速完全免疫佐劑和乳化型快速不完全佐劑的使用比例是30～50%。接近30%乳化粘度增加，接近50%乳化粘度減小。因此建議夏季使用低濃度冬季使用高濃度乳化，這樣既能得到很好的免疫效果也能減少注射時(shí)帶來的阻力困難。

六、免疫動(dòng)物

1. 免疫劑量

一般而言，需要納克到微克級(jí)的抗原加上佐劑才能誘導(dǎo)高滴度的抗體反應(yīng)，例如，兔需要免疫500～1000μg，小鼠需要10～200μg，山羊或者綿羊需要250～5000μg可溶性抗原加上乳化型快速完全免疫佐劑能誘發(fā)高滴度的抗體反應(yīng)。越小的動(dòng)物需要的抗原/佐劑混合物的濃度越低，但是產(chǎn)生抗體所需的抗原劑量并不一定必須要根據(jù)動(dòng)物的大小而增加或減少。可能一只4kg的兔需要的抗原劑量同25g小鼠所需的一樣?？乖膭┝糠浅ｊP(guān)鍵，高劑量的抗原導(dǎo)致低親和力的B細(xì)胞活化，而低劑量抗原能引起高親和力的B細(xì)胞活化。佐劑的應(yīng)用使低劑量抗原進(jìn)行免疫成為可能，佐劑能提高抗體滴度，并能減少免疫耐受產(chǎn)生的機(jī)會(huì)。

2. 免疫途徑

抗原的進(jìn)入途徑?jīng)Q定了抗原吸收、分布和代謝的速度，吸收越快，分解代謝越快，對(duì)機(jī)體的影響時(shí)間越短。吸收越快，單位時(shí)間內(nèi)的有效抗原量就越大，機(jī)體的免疫應(yīng)答就越強(qiáng)，不良反應(yīng)也越強(qiáng)。應(yīng)根據(jù)不同抗原及實(shí)驗(yàn)要求選擇不同的免疫途徑。免疫途徑包括皮內(nèi)注射、皮下注射、淋巴結(jié)內(nèi)注射、腹腔注射、靜脈注射、肌內(nèi)注射及脾內(nèi)注射等途徑?？扇苄钥乖?/span>(糖蛋白、脂蛋白、酶類、補(bǔ)體、細(xì)菌外毒素、多糖和核酸等)及抗原量少的情況下，一般多采用添加免疫佐劑，如完全免疫佐劑和不完全佐劑，在淋巴結(jié)內(nèi)或淋巴結(jié)周圍或足墊、皮內(nèi)、皮下多點(diǎn)注射的方式；顆粒性抗原(各種動(dòng)物細(xì)胞抗原、細(xì)菌抗原和寄生蟲抗原等)及抗原量多的情況下，可不添加佐劑，直接采用靜脈、腹腔、肌內(nèi)注射的方式。也可以根據(jù)具體情況，聯(lián)合不同的免疫途徑制備高效價(jià)抗體。

3. 免疫方法（以兔子為例）

（1） 皮下注射：

從靠近頸部后側(cè)的一側(cè)開始，用拇指和食指捏住皮膚。將皮膚從身體上拉開，將針插入已形成的空隙中。將針的末端從一側(cè)向另一側(cè)移動(dòng)一小段距離，以確保它不會(huì)插入肌肉或身體壁。按下活塞以注射所需的量。暫停幾秒鐘。當(dāng)針頭被拔出時(shí)，應(yīng)用食指和拇指輕輕按壓注射部位，防止接種液外滲。如下圖：

（2）肌內(nèi)注射

將兔子從籠子里取出，放在足夠粗糙的鋼絲或固體表面上，讓兔子感到舒適。應(yīng)避免讓兔子置于光滑的表面上，因?yàn)橥米訒?huì)在任何光滑的表面上收縮肌肉。

注射通常在后腿的大腿肌肉中進(jìn)行。從前部抓住腿，將注射器插入大腿肌肉靠近髖部的后部。將針插入肌肉，輕輕嘗試抽回活塞。如果遇到阻力，可以繼續(xù)進(jìn)行注射。如果出現(xiàn)血液，說明針頭誤入腿上的小靜脈或動(dòng)脈。拔出注射器，移動(dòng)到附近的部位并再次嘗試。抗原應(yīng)緩慢、平穩(wěn)地注入。注射完成后拔出針頭，輕輕按摩注射部位。如下圖：

（3）皮內(nèi)注射

皮內(nèi)注射在較大動(dòng)物的免疫接種中相當(dāng)常見。與肌內(nèi)注射一樣，皮內(nèi)注射用于以非常緩慢的速度釋放免疫原。接種物被注射在皮膚層之間，并緩慢吸收進(jìn)入體內(nèi)。

注射部位可選擇脅部高位（肋骨與髖骨之間）或背部區(qū)域。剃除適當(dāng)大小的區(qū)域以露出皮膚，用食指和拇指夾住皮膚，確認(rèn)針頭與注射器連接緊密。針頭斜面朝上，輕微刺入皮下后繼續(xù)在皮層間平行推進(jìn)至少0.5～0.7厘米。接種液應(yīng)在皮下形成致密性皰疹，拔針時(shí)用指腹壓閉針道，